? ? ?中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，已成為治療用蛋白類(lèi)生物制品生產(chǎn)的主要細胞類(lèi)型。隨著(zhù)瞬時(shí)轉染技術(shù)(transient transfection)的進(jìn)步，搭配CHO細胞進(jìn)行毫克至克級別蛋白的快速、高效生產(chǎn)，幫助推動(dòng)藥物研發(fā)階段進(jìn)程，允許更早的評估候選藥物是否具備理想屬性，從而投入更多資源生成穩定的克隆細胞系，用于后續藥物的臨床開(kāi)發(fā)。
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? ? ? ?憑借20年在核酸遞轉領(lǐng)域的深耕細作，Mirus推出了用于CHO細胞蛋白/抗體生產(chǎn)的完整瞬轉系統——CHOgro? High Yield Expression System。通過(guò)整合Mirus獨有的專(zhuān)利轉染技術(shù)及優(yōu)化的CHO培養基，相比于現有技術(shù)方案，可將蛋白表達量提升2-10倍。除此之外，該系統不含動(dòng)物源性成分，致力于穩定的提高懸浮CHO細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本文首先就影響CHO細胞在蛋白表達實(shí)驗中的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行討論，包括轉染試劑、培養基選擇、增強子使用及培養溫度優(yōu)化；Mirus CHOgro? High Yield Expression System體系，綜合考慮上述影響CHO蛋白表達的關(guān)鍵因素，并且將轉染試劑、培養基及增強子進(jìn)行優(yōu)化、整合；最后，結合Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同蛋白/抗體類(lèi)型的表達產(chǎn)量、體系放大以及細胞類(lèi)型適配性數據，充分證明了Mirus CHOgro? High Yield Expression System具備高產(chǎn)量、高穩定性、廣泛的適配性以及操作靈活性等優(yōu)勢。

Mirus CHOgro? High Yield Expression System（產(chǎn)品貨號：MIR 6270）中包括了以下組分：

CHO細胞蛋白表達關(guān)鍵影響因素之轉染試劑

CHOgro? High Yield Expression System系統中關(guān)鍵組分TransIT-PRO?轉染試劑，通過(guò)優(yōu)化瞬時(shí)轉染效率，可進(jìn)一步提高目標蛋白/抗體產(chǎn)量。同樣的，該轉染試劑不含動(dòng)物源成分，可以與懸浮CHO或者293細胞搭配使用，并且可以兼容不同種類(lèi)的培養基，旨在提高生產(chǎn)蛋白/抗體產(chǎn)量及穩定性。

測試使用CHOgro? High Yield Expression System系統中TransIT-PRO?轉染試劑（試劑:DNA比例為1:1），在CHO-S細胞瞬轉表達GFP熒光蛋白。轉染后48小時(shí)，分別使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測試劑轉染效率和細胞活力。結果表明，單獨使用TransIT-PRO?轉染試劑，可達到高水平的轉染效率（圖1）。

圖1. 單獨使用Mirus CHOgro? High Yield Expression系統中的轉染試劑（TransIT-PRO? 轉染試劑），也有著(zhù)高水平的轉染效率。

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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之培養基

CHOgro? High Yield Expression System中的另一關(guān)鍵組分CHOgro? Expression Medium，也是提升CHO細胞蛋白/抗體表達量的重要因素。細胞的生長(cháng)狀態(tài)、是否結團、細胞密度等都是評估CHO細胞培養基的關(guān)鍵參數。

在細胞生長(cháng)狀態(tài)方面，轉染FreeStyle? CHO-S細胞后，分別在CHOgro? Expression Medium和其他品牌培養基中進(jìn)行培養。轉染后六天，用CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium培養的細胞結團數量明顯少于其他品牌培養基（圖2）。

圖2. 使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium進(jìn)行培養（左），細胞結塊數量顯著(zhù)少于其他培養基培養的CHO-S細胞（右）。

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同樣的，使用相同細胞系（FreeStyle? CHO-S）及細胞密度（0.5×106 cells/ml），平行比較Mirus CHOgro? Expression培養基及其他品牌培養基。實(shí)驗結果顯示，在Mirus CHOgro? Expression培養基中生長(cháng)的細胞，有著(zhù)更高的細胞密度，這也是提高CHO細胞蛋白/抗體產(chǎn)量的重要前提。并且，在更高的細胞密度條件下，仍保持較高的細胞活性（圖3）。

圖3. 使用CHOgro? Expression Medium培養，CHO細胞密度更高，并且保持著(zhù)較高細胞活性。

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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之增強子

使Mirus研發(fā)團隊針對不同應用或者細胞類(lèi)型，開(kāi)發(fā)出多種相適配增強子，例如針對CHO細胞蛋白/抗體生產(chǎn)的增強子CHOgro? Titer Enhancer，也是包含在CHOgro? High Yield Expression System中的一個(gè)關(guān)鍵組分。其作用機制并非直接增加細胞的轉染效率，而是通過(guò)調節細胞內特定的信號通路來(lái)增加CHO細胞的蛋白表達滴度。平行實(shí)驗分別對比了CHO細胞對Fc融合蛋白與IgG的表達量，結果表明，與單獨使用TransIT-PRO? 轉染試劑相比，加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著(zhù)提升（圖4）。此外，與PEI轉染體系相比，使用CHOgro系統的轉染試劑和增強子，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍（圖5）。

圖4. 加入CHOgro? Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著(zhù)提升

圖5. TransIT -PRO?轉染試劑搭配CHOgro? Titer Enhancer，相較于PEI轉染體系，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍

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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之培養溫度

Mirus CHOgro? High Yield Expression System除了通過(guò)培養基、轉染試劑以及增強子三者的優(yōu)化結合，在實(shí)驗流程上也可以進(jìn)行優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高蛋白產(chǎn)量。根據科研或者不同應用需求，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著(zhù)多種靈活實(shí)驗方案供選擇：

方案一：Mirus CHOgro? High Yield Expression System實(shí)驗方案中所推薦的標準流程，即在轉染當天加入CHOgro? Titer Enhancer，并立刻將細胞培養溫度從37℃轉移至32℃，轉染后7-8天內收獲蛋白，細胞活性仍可保持70%以上；

方案二：在方案一的基礎上通過(guò)添加補料來(lái)延長(cháng)細胞培養時(shí)間，保證細胞更長(cháng)時(shí)間維持較高的密度和活率，將蛋白收獲時(shí)間延長(cháng)至7-11天；

方案三：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養，不加入補料，并在最短時(shí)間（4-5天）收獲蛋白；

方案四：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養，通過(guò)在轉染后18-24小時(shí)添加補料維持細胞密度和活率，將蛋白收獲時(shí)間延長(cháng)至4-7天。（有關(guān)添加細胞培養補料以維持細胞活率的建議，請參閱完整版實(shí)驗方案）（圖6）。

圖6. CHOgro? High Yield Expression System的多種細胞培養方案

基于以上四種實(shí)驗方案，分別測試了在轉染后32℃和37℃培養條件下，以及是否添加補料對CHO細胞IgG產(chǎn)量的影響。實(shí)驗使用CHOgro? High Yield Expression System，加入轉染復合物及CHOgro? Titer Enhancer后，立即將CHO細胞轉移至32℃（左）或保持在37℃（右）。結果顯示，轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養，IgG產(chǎn)量更高且細胞存活時(shí)間更長(cháng)（圖7）。

圖7. 轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養，IgG產(chǎn)量更高且細胞存活時(shí)間更長(cháng)

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盡管Mirus CHOgro? High Yield Expression System從CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵組分即轉染試劑、培養基和增強子進(jìn)行了優(yōu)化整合，并提供了靈活的實(shí)驗應用方案來(lái)提升CHO細胞的蛋白產(chǎn)量，那么在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，該系統針對不同類(lèi)型蛋白/抗體的產(chǎn)量、體系放大以及細胞類(lèi)型適配性如何呢？

Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同類(lèi)型蛋白/抗體的表達，有著(zhù)更高產(chǎn)量

使用相同的細胞類(lèi)型（FreeStyle? CHO-S cells）和質(zhì)粒骨架，分別表達六種不同的治療性抗體，比較測試了Mirus CHOgro? High Yield Expression System和其他品牌表達系統。實(shí)驗結果表明，在所有測試的六種抗體類(lèi)型中，使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System的CHO細胞表達的蛋白滴度更高，并且轉染試劑用量更少，蛋白生產(chǎn)成本更低（圖8）。

圖8. 相比其他品牌CHO轉染表達系統，Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著(zhù)更高的蛋白產(chǎn)量

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CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規模的可擴展性

通過(guò)對6孔板（細胞培養體積2mL）至5L搖瓶（細胞培養體積2L）等不同培養體積進(jìn)行轉染，對CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規模的可擴展性進(jìn)行評估，實(shí)驗結果表明，從最小反應體系（6孔板）至最大反應體系（5L搖瓶），生產(chǎn)體系放大了1000倍，都有著(zhù)近似的蛋白滴度，意味著(zhù)CHOgro? High Yield Expression System可以整合到不同CHO細胞蛋白/抗體研究和生產(chǎn)工作流中（圖9）。

圖9. Mirus CHOgro? High Yield Expression System的生產(chǎn)體系擴大1000倍，依然保持著(zhù)近似的蛋白產(chǎn)量。

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CHOgro? High Yield Expression System不同CHO細胞適配性

選擇兩種常用于蛋白/抗體生產(chǎn)的CHO懸浮細胞CHO-S和ExpiCHOTM，評估CHOgro? High Yield Expression System對不同CHO細胞類(lèi)型的適配性。實(shí)驗結果表明，CHOgro? High Yield Expression System可適配多種CHO細胞類(lèi)型，在不同CHO細胞中的蛋白表達也有著(zhù)近似的產(chǎn)量（圖10）。

圖10. Mirus CHOgro? High Yield Expression System可適配不同CHO細胞類(lèi)型

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綜合上述，通過(guò)上述Mirus CHOgro? High Yield Expression System的測評數據，表明了該系統具有以下特點(diǎn)及優(yōu)勢：

• 更高的蛋白產(chǎn)量：可將CHO細胞瞬轉的蛋白表達量提升2-10倍
• 可穩定放大生產(chǎn)體系：將轉染體系放大1000倍，其蛋白表達量依然保持穩定
• 適配不同類(lèi)型CHO細胞：搭配不同類(lèi)型CHO細胞也可得到近似蛋白產(chǎn)量

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如何查找或選擇適合的轉染試劑？

? ? 請登錄Mirus官網(wǎng)線(xiàn)上工具Reagent Agent?，支持超過(guò)1000種細胞類(lèi)型、多種核酸類(lèi)型轉染試劑查詢(xún)。

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Mirus產(chǎn)品年鑒

? ? ? ?美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開(kāi)發(fā)高效、低毒轉染試劑的公司，同時(shí)也是該類(lèi)試劑的主要供應商之一。其產(chǎn)品線(xiàn)涵蓋化學(xué)轉染試劑、電轉染產(chǎn)品、病毒生產(chǎn)和轉導產(chǎn)品，適用于基因功能研究、蛋白生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)和動(dòng)物模型構建等領(lǐng)域。Mirus被公認為轉染試劑開(kāi)發(fā)的領(lǐng)跑者，其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶(hù)的好評。

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? ? 北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理，始終秉承著(zhù)專(zhuān)業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)，Mirus熱銷(xiāo)轉染產(chǎn)品常備現貨。如果您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.wlsfby.com了解更多產(chǎn)品信息。

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