基于需要遞轉不同種類(lèi)核酸/蛋白類(lèi)型研究，在細胞轉染環(huán)節，研究者們常碰到如下三類(lèi)問(wèn)題：

1. 細胞對化學(xué)試劑較為敏感，轉染后，細胞活率下降或死亡；
2. 研究常用細胞類(lèi)型較多，不同類(lèi)型細胞，轉染效率差異較大，導致單個(gè)轉染試劑或者實(shí)驗流程，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗需求；
3. 遞轉多種類(lèi)型核酸或蛋白，需要挑選對應的轉染試劑，并且需要大量實(shí)驗優(yōu)化，才可以得到較高的轉染效率。

有沒(méi)有一款化學(xué)轉染試劑，可以同時(shí)應對常規到難轉染的細胞類(lèi)型，有著(zhù)較低的細胞毒性，并且適用于多種核酸/蛋白類(lèi)型遞轉呢？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉染試劑，可同時(shí)應對常見(jiàn)細胞及難轉染細胞類(lèi)型，避免條件摸索和大量的重復性實(shí)驗，輕松得到您理想的實(shí)驗結果。

• 已驗證在大多數細胞類(lèi)型中（如貼壁/懸浮細胞、原代細胞、神經(jīng)細胞等），都有著(zhù)優(yōu)異的轉染效率、低毒性（特別相對于形成脂質(zhì)體復合物的Lipofectamine®系列試劑）、高性能的表現；
• 適用于多種研究領(lǐng)域，包括但不限于干細胞研究、基因編輯CRISPR研究、RNAi基因干擾/沉默、穩轉細胞株構建、低毒性的轉染實(shí)驗、共轉染實(shí)驗等；
• 允許高效且穩定的同時(shí)遞轉多種核酸/蛋白類(lèi)型，包括但不限于質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分。

為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著(zhù)如此高性能及廣泛適應性呢？這歸因于Mirus強大且高效的專(zhuān)利遞轉平臺設計，可進(jìn)行多重、多功能組合的轉染試劑組分篩選并優(yōu)化。成立于1995年的Mirus，專(zhuān)注及深耕核酸遞轉領(lǐng)域多年（圖1），從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®，都是基于該遞轉平臺進(jìn)行設計及開(kāi)發(fā)的。截至目前，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過(guò)1萬(wàn)篇，并且發(fā)表文章及Mirus數據庫涵蓋了超過(guò)1200種細胞類(lèi)型，更多文章及數據查詢(xún)，請點(diǎn)擊這里。

圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒

不同于傳統基于單組分的轉染試劑（如陽(yáng)離子聚合物或陽(yáng)離子脂質(zhì)體），為了進(jìn)一步提高轉染效率，以應對不同細胞類(lèi)型或特定的應用。Mirus將專(zhuān)利的多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進(jìn)行多重組合，在不形成脂質(zhì)體復合物（即liposome，通常具有細胞毒性）前提條件下，得到多種類(lèi)、高性能的轉染方案，克服細胞遞轉過(guò)程中的多重阻礙，以實(shí)現更高效轉染和更低的細胞毒性（圖2）。

圖2 Mirus轉染試劑原理示意圖

基于上述Mirus強大、高效的專(zhuān)利遞轉平臺設計，在進(jìn)行多重、多組合篩選、優(yōu)化及后續驗證，獨有的智能迭代設計流程，優(yōu)化轉染技術(shù)中的每個(gè)組分（圖3）。Mirus推出一系列經(jīng)典轉染試劑，以應對多種需求：

1. 廣譜、高性能、低毒性的轉染試劑家族: TransIT-X2®、TransIT®-LT1、TransIT®-2020
2. 針對特定細胞類(lèi)型的轉染試劑家族：TransIT®-293、TransIT®-BrCa、TransIT®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER®、TransIT®-Insect、TransIT®-Jurkat、TransIT®-Keratinocyte
3. 針對特定應用的轉染試劑家族：

-      病毒生產(chǎn)：VirusGEN® 轉染試劑及配套試劑盒、TransIT®-Lenti

-      蛋白/抗體生產(chǎn)：TransIT-PRO®、CHOgro® Expression System、CHOgro® High Yield Expression System

4. 寡核苷酸遞轉的轉染家族：TransIT®-Oligo、TransIT-siQUEST®、TransIT-TKO®
5. mRNA及長(cháng)鏈RNA遞轉：TransIT®-mRNA

圖3 Mirus獨有智能迭代設計，轉染試劑優(yōu)化流程示意圖

Mirus TransIT-X2®轉染試劑性能數據展示

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉表達EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細胞(NHDF)細胞中。實(shí)驗使用96孔板， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4μl，DNA加入量為0.1μg(使用試劑:DNA=2:1、3:1或4:1)。轉染后48小時(shí)，使用Guava® easyCyte? 5HT流式細胞儀重復檢測三次，評估轉染效率。

圖4 TransIT-X2®在包括原代細胞在內的多種細胞類(lèi)型中都具有較高轉染效率

使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細胞中，轉染24小時(shí)，通過(guò)熒光素酶活性評估轉染效率，定量受損細胞中釋放的LDH評估細胞毒性。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細胞相比，在最佳試劑:DNA比例下，Trans - x2®有著(zhù)更高的熒光強度及更低的細胞毒性。

圖5 相較于使用單一組分且形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉染試劑，TransIT-X2®有著(zhù)更高的轉染效率及更低細胞毒性

實(shí)驗Tips: 針對更多特定細胞類(lèi)型，試劑使用建議，詳細請見(jiàn)：Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).

Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實(shí)驗中性能數據展示

基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細胞生物學(xué)中發(fā)揮著(zhù)重要作用，化學(xué)轉染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。常見(jiàn)參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

-      小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp)；

-      微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類(lèi)短的、單鏈 RNA(20-22nt)。

利用 RNAi 抑制基因表達的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA)，這些短 RNA 序列可通過(guò)病毒或非病毒載體方式進(jìn)行表達，更多詳細信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。

圖6  不同RNAi干擾途徑示意圖

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉染試劑用于轉染siRNA(靶點(diǎn)為內源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1)，對照使用正常人類(lèi)真皮成纖維細胞(NHDF)遞轉非靶向siRNA。Trans IT-X2®加入量為4μl， Lipofectamine®2000加入量為6μl，siRNA加入量都為25 nM。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平測量GAPDH或AHA1 mRNA進(jìn)行檢測，轉染后48小時(shí)均一化至非靶向對照組的mRNA水平，誤差則為三次復孔實(shí)驗的標準差。

圖7  基于siRNA核酸遞轉類(lèi)型的基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著(zhù)更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉染試劑用于轉染Pre-miR? hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana? miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗證，可降低PTK9 mRNA表達水平)。Pre-miR?陰性質(zhì)控用于評估mRNA表達水平基線(xiàn)值。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3μl， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平，經(jīng)過(guò)陰性質(zhì)控的均一化，得到PTK9 mRNA表達水平值。

圖8  基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著(zhù)更高的基因沉默效率

Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實(shí)驗中性能數據展示

經(jīng)過(guò)改造及優(yōu)化的細菌 CRISPR/Cas9 系統，已被廣泛應用到哺乳細胞的基因編輯中。基于CRISPR基因編輯實(shí)驗常見(jiàn)兩組分：Cas9蛋白及引導RNA(gRNA)。當Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA，會(huì )觸發(fā)兩種內源性修復機制，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(HDR)，以應對細胞中產(chǎn)生的DNA斷裂。基于NHEJ細胞修復通路，為非精準、且容易出錯細胞修復通路，可引入導致基因功能缺失的Indel。基于HDR的細胞修復通路，則需要額外的同源 DNA 作為修復模板，從而實(shí)現“精準”修復，在目的基因插入特定的基因或長(cháng)片段序列。

根據研究者們不同的實(shí)驗需求，CRISPR基因編輯可以有多種類(lèi)型實(shí)驗設置，這意味需要面對不同核酸類(lèi)型的轉染甚至共轉染，舉例如下：

1.      質(zhì)粒pDNA轉染

作為CRIPSR實(shí)驗關(guān)鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA，可以設計單個(gè)質(zhì)粒DNA，共同表達兩組分(A)；或者使用兩質(zhì)粒系統，其中一個(gè)質(zhì)粒表達Cas9蛋白，另外一個(gè)質(zhì)粒表達gRNA(B)；當使用Cas9切口酶(Nickase)，則需要兩條gRNA，這時(shí)可能需要三質(zhì)粒系統的遞轉實(shí)驗。

2.      質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉染

此時(shí)，與上述實(shí)驗設計不同的是，gRNA以寡核苷酸形式進(jìn)行遞轉，這就意味著(zhù)遞轉實(shí)驗需要同時(shí)轉染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B)。

3.      mRNA及RNA寡核苷酸共轉染

為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導致的脫靶效應，可以共轉染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。

4.      Cas9/gRNA RNP復合物遞轉

隨著(zhù)Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟，越來(lái)越多的研究者們選擇直接從第三方購買(mǎi)高保真Cas9蛋白，以及有著(zhù)額外化學(xué)修飾且在細胞內更穩定的gRNA寡核苷酸。除了極大的縮短和簡(jiǎn)化CRISPR實(shí)驗流程外，相對于質(zhì)粒或者mRNA方式合成，直接遞轉RNP復合物的方式有著(zhù)更高的特異性及編輯效率。

實(shí)驗Tips: 針對上述不同CRISPR實(shí)驗設計及遞轉情形，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實(shí)驗說(shuō)明， 下載鏈接如下：

TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 μl/孔，24孔板, Mirus Bio)共轉染0.5 μg質(zhì)粒DNA(表達Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細胞中，轉染后48小時(shí)，T7E1驗證切割效率。

圖9 質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉染：TransIT-X2®分別在293T/17、U2OS和NHDF細胞中共轉Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸)，都有著(zhù)較高的基因編輯效率(18-48%)

2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復合體，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 μl/孔， Mirus Bio)、Lipofectamine® CRISPRMAX? (1.5 μl/孔， ThermoFisher) 、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 μl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 μl/孔ThermoFisher) 遞轉至293T/17及U2OS細胞中。測試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM)，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM)，轉染后48小時(shí)，T7E1驗證切割效率。

圖10 Cas9/gRNA RNP復合體遞轉：相較于Lipofectamine®系列轉染試劑，TransIT-X2®有著(zhù)更高的切割效率

Mirus TransIT-X2®產(chǎn)品優(yōu)勢

?新型基于多組分開(kāi)發(fā)的廣譜型轉染試劑(適用于多種細胞，包括難轉細胞)；

? 可同時(shí)轉染核酸及蛋白，包括不限于DNA，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復合物；

?不形成脂質(zhì)體復合物，降低細胞毒性；

? 滿(mǎn)足多種應用：基因過(guò)表達、基因沉默、基因編輯、干細胞研究、穩轉細胞株構建等。

相關(guān)產(chǎn)品信息

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美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開(kāi)發(fā)高效、低毒轉染試劑的公司，同時(shí)也是目前該類(lèi)試劑主要的供應商之一。Mirus被公認為轉染試劑開(kāi)發(fā)的領(lǐng)跑者，其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶(hù)的好評。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理，始終秉承著(zhù)專(zhuān)業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。如果您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.wlsfby.com了解更多產(chǎn)品信息。